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Jun 23, 2023

피내 전달된 mRNA

자연의생명공학과

Nature Biomedical Engineering (2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

메신저 RNA 치료제의 성공은 유전 물질을 기능성 단백질로 안전하고 효과적이며 안정적으로 번역할 수 있는 전달 시스템의 가용성에 크게 좌우됩니다. 여기에서 우리는 인간 진피 섬유아세포의 세포 나노천공을 통해 생성된 세포외 소포(EV)와 세포외 기질 α1 I형 콜라겐(COL1A1)을 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하면 콜라겐-단백질 이식편의 형성이 유도되고 콜라겐-단백질의 주름 형성이 감소한다는 것을 보여줍니다. 광노화된 피부를 가진 생쥐의 고갈된 피부 조직. 우리는 또한 마이크로니들 어레이를 통해 mRNA가 로드된 EV의 피내 전달이 동물의 진피에서 콜라겐의 장기간 및 보다 균일한 합성 및 교체로 이어진다는 것을 보여줍니다. EV 기반 COL1A1 mRNA의 피내 전달은 광노화 피부 치료를 위한 효과적인 단백질 대체 치료법을 만들 수 있습니다.

메신저 RNA 변형 기술의 최근 개발은 mRNA 전달의 치료 효율성과 단백질 대체 요법 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스에 대한 백신 접종을 포함한 단기 임상 적용 가능성을 향상시켰습니다. 2. 그러나 mRNA의 본질적인 무능력과 잠재적인 면역원성은 전달 수단 내에 캡슐화되어야 합니다. 현재 mRNA 전달 양식은 캡슐화 및 수송을 위한 지질 나노입자(LNP) 운반체의 사용에 중점을 두고 있습니다3,4. 그러나 LNP는 세포독성, 생체분포 불량, 표적 특이성 부족, 면역원성 등 여러 가지 주요 과제를 안고 있습니다. 이러한 문제는 순환 반감기를 개선하고 비특이적 제거율을 줄이기 위해 LNP의 표면 PEG화(PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)를 나타냄)에 대한 요구 사항으로 인해 발생할 수 있습니다5,6. 특히, 사람에게 LNP를 투여하는 것은 아나필락시스, 과민증 및 자가면역 부작용과 관련이 있습니다7,8. 따라서 이러한 LNP 관련 과제 중 일부를 극복할 수 있는 mRNA 운반체를 식별하는 것은 mRNA 기반 치료법의 추가 개발에 도움이 될 것입니다.

엑소좀과 미세소포를 포함한 세포외 소포(EV)는 인체 내에서 mRNA를 포함한 생체분자와 핵산의 수송에 중요한 역할을 합니다9,10,11. 그 결과, 최근 몇 년 동안 EV는 본질적인 생체 적합성, 생리적 장벽을 통과하는 능력 및 낮은 면역원성으로 인해 핵산 기반 치료제의 유망한 운반체로 부상했습니다. LNP와 달리 엑소좀을 포함한 EV는 신체 세포에서 내인적으로 생성되며 염증 반응 수준을 낮춥니다. 또한, 엑소좀을 저렴하고 쉽게 대량으로 생산할 수 있는 전략도 개발됐다. 우리는 이전에 분비된 EV에 전체 전사 mRNA의 대규모 로딩을 허용하기 위해 소스 세포의 표면에 일시적인 나노미터 기공이 생성되는 세포 나노포레이션(CNP) 방법을 보고했습니다. 여기에서는 인간의 노화로 손상된 피부의 병리생리학적 특징을 밀접하게 모방하는 급성 광노화 마우스 모델을 사용하여 광노화에 대한 항노화 치료제로서 진피 콜라겐 단백질 손실을 대체하는 엑소좀 기반 COL1A1 mRNA 치료법의 유용성을 보여줍니다. 피부. mRNA 전달 및 유지 효율성을 향상시키기 위해 히알루론산(HA) 미세바늘(COL1A1-EV MN) 패치를 통해 콜라겐 mRNA를 전달하면 진피에서 mRNA가 보다 효율적으로 분포되어 내구성 있는 콜라겐이 생성된다는 것도 보여줍니다. -단백질 접목 및 광노화된 피부의 주름 치료 개선.

돌이킬 수 없는 콜라겐 손실로 인한 피부 위축은 피부 노화의 특징입니다16,17. 일반의약품 및 의약품 접근법(항산화제18,19,20, 레티노이드21, 펩타이드22,23)부터 의료 기기(예: 레이저 요법24 및 합성 피부 필러25,26)에 이르기까지 피부 내 콜라겐 단백질 손실을 회복하기 위한 수많은 방법이 있습니다. . 그러나 이러한 기존 기술 중 어느 것도 시간이 지남에 따라 피부 강도, 견고함 및 탄력을 유지하기 위해 장기적인 내인성 콜라겐 대체를 달성할 수 없었습니다27,28,29. 콜라겐 단백질 합성을 담당하는 섬유아세포를 자극하는 것도 피부 노화를 단기적으로 조절하는 효과적인 방법이 될 수 있습니다30. 그러나 섬유아세포는 노화됨에 따라 콜라겐을 증식하고 합성하는 능력을 점차 잃어 노화 방지 치료를 위한 장기적인 콜라겐 대체 방법이 어려워집니다31. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 EV 매개 mRNA 전달을 통해 광노화 콜라겐 고갈 모델에서 콜라겐 단백질을 대체하는 것을 목표로 했습니다. 인간 콜라겐 I 알파 I(COL1A1) mRNA가 탑재된 EV를 생성하기 위해 우리는 나노기공 표면에 신생아 인간 진피 섬유아세포(nHDF)의 단층을 도금하고 COL1A1-GFP 플라스미드로 세포를 나노형질감염시키는 CNP 기술을 사용했습니다. 그림 1a 및 보충 그림 1a) 14. EV는 형질감염 다음날 배양 배지로부터 분리되었습니다. CNP 처리 세포는 이전에 설명한 큐벳 스타일 병렬 전극을 사용하여 수행된 표준 벌크 전기천공법(BEP)으로 처리된 세포 또는 배양 중 처리되지 않은 nHDF와 비교하여 세포당 EV 수치가 10배 더 높은 것으로 나타났습니다(그림 .1b). 각 방법에 의해 생성된 EV는 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 결정된 직경 약 150nm에서 정점에 달하는 크기 분포와 동적 광산란(DLS)에 의해 모드 피크에서 강도의 80%를 특징으로 합니다(그림 1c 및 보충). 그림 1b, c) 다분산 지수(PDI)는 0.12-0.25입니다. 웨스턴 블롯 실험에서는 CNP 처리군에서 엑소좀(CD9, CD63, TSG101)과 미세소포체(ARF6) 바이오마커의 발현이 처리되지 않은 그룹보다 유의하게 높았으며 분비된 EV의 증가를 확인했습니다(보충 그림 1d). 동역학 분석에 따르면 전압 최적화 EV 방출은 CNP 유도 후 8시간에 최고조에 달했으며 다음 24시간 동안 지속적인 분비가 기록되었습니다(보충 그림 1e, f). 역전사 정량적 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)은 CNP가 분비하는 EV가 BEP가 분비하는 EV보다 COL1A1 mRNA를 200배 이상 함유하고, 비형질감염 세포에서 분비되는 EV보다 3,000배 더 높은 COL1A1 mRNA를 함유하고 있음을 보여주었습니다(그림 1d). ). 겔 아가로스의 바이오분석기 평가는 ~4,000개의 뉴클레오티드에서 전체 길이의 전사된 COL1A1 mRNA를 입증했습니다(그림 1e). CNP로 제조한 EV는 저온 전자 현미경(cryo-EM), 원자력 현미경(AFM) 및 NTA로 평가할 때 모양, 막 및 크기 특성의 변화 없이 4°C에서 전임상 투여를 위해 보관했을 때 구조적 안정성을 나타냈습니다(보조 그림). .2a–c). 또한 EV 내에 캡슐화 된 COL1A1 mRNA는 실온과 4 ° C 모두에서 안정적이었고 혈청 안정성도 나타내어 향후 임상 유용성에 대한 잠재력을 강조했습니다 (보충 그림 2d, e).